Microscopie Moléculaire des Membranes (MMM)

Daniel Levy

Daniel Lévy Chef d'équipe Tél :

aurelie_bertin

Aurelie Bertin Responsable de projet Tél :

Les protéines membranaires sont impliquées dans les processus cellulaires majeurs, par exemple, l’homéostasie cellulaire, la bioénergétique et la communication. Près de 25 % des gènes codent une protéine membranaire et plus de 50 % de ces protéines constituent la cible d’agents thérapeutiques actuellement utilisés.

Figure 1 : Nous nous intéressons à l'analyse fonctionnelle et structurale des protéines membranaires. Les fonctions sont analysées après purification et reconstitution dans des protéoliposomes. Les structures sont déterminées par cryo-microscopie électronique de pro
Figure 1 :
Nous nous intéressons à l’analyse fonctionnelle et structurale des protéines membranaires. Les fonctions sont analysées après purification et reconstitution dans des protéoliposomes. Les structures sont déterminées par cryo-microscopie électronique de pro

Les connaissances au niveau moléculaire nécessaires à la conception de nouveaux outils pharmacologiques sont bien en deçà de celui des protéines cytoplasmiques. Cela est dû à leur caractère amphiphile qui complique leur manipulation, des étapes de surexpression à la  cristallisation en passant par celles de purification.
Dans ce contexte, nous étudions la fonction des protéines membranaires purifiées après reconstitution dans des liposomes et leur structure par microscopie électronique (Figure 1). Les protéines membranaires à l’étude sont impliquées dans la détoxification et la multi-résistance cellulaire aux médicaments, ainsi que dans la bioénergétique cellulaire.

Les protéines membranaires purifiées en détergent sont reconstituées dans une membrane lipidique sous forme de protéoliposomes afin d’étudier leur fonction dans un système plus simple que la membrane native. Pour l’analyse structurale, nous utilisons la cryo-microscopie électronique pour recueillir des informations structurales à haute résolution (1-2 nm) sur les protéines purifiées en détergent et/ou après reconstitution dans un environnement semblable à un environnement membranaire.
Nous développons également de nouvelles méthodes afin de réduire la quantité de protéines par analyse et d’accéder aux protéines membranaires humaines peu exprimées.

Nos projets et résultats les plus significatifs au cours des dernières années comprennent :

Organisation supramoléculaire des protéines membranaires

Figure 2 Image A: Appareil photosynthétique bactérien. Image B: (1) Reconstruction 3D par cryo-microscopie électronique du core complexe de Rb. veldkampii contenant une sous-unité PufX incapable de former des dimères. (2) Carte de projection du core complexe dimérique de Rb. sphaeroides avec une organisation de sous-unités comprenant une paire de Pufx maintenant le reste du dimère. Image C: (1, 2) Membranes tubulaires de Rb. sphaeroides contenant des core complexes dimériques. (3) Modèle d'un dimère de PufX maintenu par le motif GXXXG présent dans Rb. sphaeroides et absent dans la séquence de PufX de Rb. veldkampii. (5) L'angle entre les deux PufX conduit à la formation d'un core complexe dimérique convexe qui courbe la membrane dans des zones enrichies et conduit à des invaginations tubulaires. Image D: Proposition de mécanisme d'assemblage de sous-unités au cours de la biosynthèse des core complexes. Chez Rb. sphaeroides, après dimérisation de PufX (ellipse rose), des sous-unités α (cercles bleus) et β (cercles verts) sont assemblées par paires conduisant à des antennes de courbure opposée qui ne peuvent se refermer pour des raisons stériques. L'ouverture des antennes pourrait constituer un passage de choix pour les quinones vers le cyt. bc1. Chez Rb. velkampii, Pufx ne dimérise pas et les sous-unités α et β sont assemblées par paires jusqu'à la fermeture.
Figure 2 : Image A: Appareil photosynthétique bactérien. Image B: (1) Reconstruction 3D par cryo-microscopie électronique du core complexe de Rb. veldkampii contenant une sous-unité PufX incapable de former des dimères. (2) Carte de projection du core complexe dimérique de Rb. sphaeroides avec une organisation de sous-unités comprenant une paire de Pufx maintenant le reste du dimère. Image C: (1, 2) Membranes tubulaires de Rb. sphaeroides contenant des core complexes dimériques. (3) Modèle d’un dimère de PufX maintenu par le motif GXXXG présent dans Rb. sphaeroides et absent dans la séquence de PufX de Rb. veldkampii. (5) L’angle entre les deux PufX conduit à la formation d’un core complexe dimérique convexe qui courbe la membrane dans des zones enrichies et conduit à des invaginations tubulaires. Image D: Proposition de mécanisme d’assemblage de sous-unités au cours de la biosynthèse des core complexes. Chez Rb. sphaeroides, après dimérisation de PufX (ellipse rose), des sous-unités α (cercles bleus) et β (cercles verts) sont assemblées par paires conduisant à des antennes de courbure opposée qui ne peuvent se refermer pour des raisons stériques. L’ouverture des antennes pourrait constituer un passage de choix pour les quinones vers le cyt. bc1. Chez Rb. velkampii, Pufx ne dimérise pas et les sous-unités α et β sont assemblées par paires jusqu’à la fermeture.

Les supercomplexes de protéines membranaires sont l’assemblage supramoléculaire de protéines membranaires pouvant fonctionner individuellement, mais assemblées dans un supercomplexe afin d’augmenter le rendement des réactions catalytiques. Les supercomplexes ont été rapportés dans la respiration, la photosynthèse bactérienne et chez les plantes ou dans les multirésistances aux médicaments. Ce concept récent dans le cas des protéines membranaires est le plus avancé dans la photosynthèse bactérienne. Cela fait de ces protéines des modèles intéressants pour la compréhension des paramètres structuraux impliqués dans l’assemblage et la stabilisation de super-complexes de protéines membranaires. Une large étude structurale comparative sur plusieurs complexes photosynthétiques nous a permis de mieux comprendre la biosynthèse et l’assemblage d’un type de supercomplexe membranaire et également d’apporter de nouveaux éléments à la compréhension des chaînes  de transduction énergétique dans les cellules (Figure 2) (1,2)

Analyse structurale de transporteurs MDR (multi-résistance aux xénobiotiques)

 

 

 

Fig.3: Les protéines de multi-résistance aux molécules hydrophobes hydrolysent l'ATP pour l'efflux de divers xénobiotiques. Trois transporteurs MDR humains ont été trouvés dans des cellules tumorales et transportent plusieurs médicaments
Figure 3 :
Les protéines de multi-résistance aux molécules hydrophobes hydrolysent l’ATP pour l’efflux de divers xénobiotiques. Trois transporteurs MDR humains ont été trouvés dans des cellules tumorales et transportent plusieurs médicaments

Un effort particulier est consacré à la détermination de la structure des transporteurs membranaires dits ABC qui hydrolysent l’ATP pour le transport transmembranaire de divers xénobiotiques et la détoxification cellulaire. Certains ABC confèrent un phénotype de multi-résistance aux médicaments (MDR), des bactéries pour la résistance aux antibiotiques à l’homme pour l’élimination de médicaments anti-cancéreux. Notre projet comprend l’analyse structurale de transporteurs MDR humains et d’homologues bactériens impliqués dans le transport des médicaments anti-cancéreux avec l’objectif final de contribuer au développement de nouveaux inhibiteurs (Figure 3). Nous avons récemment décrit le transport de substrats au niveau moléculaire par BmrA, un transporteur MDR homologue à la Pgp humaine (3).

 

Nouvelles méthodes pour l’analyse structurale de protéines membranaires peu exprimées

 

Fig.4: Nouvelles stratégies visant à réduire la quantité de protéines membranaires pour l'analyse structurale. A) Cristallisation 2D sur un film lipidique contenant un ligand lipidique des protéines.
Figure 4 :
Nouvelles stratégies visant à réduire la quantité de protéines membranaires pour l’analyse structurale. A) Cristallisation 2D sur un film lipidique contenant un ligand lipidique des protéines.

En parallèle, nous développons de nouvelles méthodes afin de réduire au niveau de la picomole, la quantité de protéines pour l’analyse structurale pour accéder aux protéines membranaires humaines peu exprimées. Le concept de base repose sur la concentration de protéines présentes dans un volume vers une surface, par exemple, une surface fonctionnalisée de lipides ou une bicouche plane supportée. Les deux stratégies sont utilisées pour l’analyse des transporteurs MDR eucaryotes (Fig 4) (4).

Publications clés

Année de publication : 2017

P Guichard, V Hamel, M Le Guennec, N Banterle, I Iacovache, V Nemčíková, I Flückiger, K N Goldie, H Stahlberg, D Lévy, B Zuber, P Gönczy (2017 Mar 24)

Cell-free reconstitution reveals centriole cartwheel assembly mechanisms.

Nature communications : 14813 : DOI : 10.1038/ncomms14813

Année de publication : 2014

Guillaume van Niel, Ptissam Bergam, Aurelie Di Cicco, Ilse Hurbain, Alessandra Lo Cicero, Florent Dingli, Roberta Palmulli, Cecile Fort, Marie Claude Potier, Leon J Schurgers, Damarys Loew, Daniel Levy, Graça Raposo (2014 Nov 13)

Apolipoprotein E Regulates Amyloid Formation within Endosomes of Pigment Cells.

Cell reports : 43-51 : DOI : 10.1016/j.celrep.2015.08.057
Ayako Yamada, Alexandre Mamane, Jonathan Lee-Tin-Wah, Aurélie Di Cicco, Coline Prévost, Daniel Lévy, Jean-François Joanny, Evelyne Coudrier, Patricia Bassereau (2014 Apr 7)

Catch-bond behaviour facilitates membrane tubulation by non-processive myosin 1b.

Nature communications : 3624 : DOI : 10.1038/ncomms4624

Année de publication : 2013

Pierre Frederic Fribourg, Mohamed Chami, Carlos Oscar S Sorzano, Francesca Gubellini, Roberto Marabini, Sergio Marco, Jean-Michel Jault, Daniel Lévy (2013 Aug 7)

3D cryo-electron reconstruction of BmrA, a bacterial multidrug ABC transporter in an inward-facing conformation and in a lipidic environment.

Journal of molecular biology : 2059-69 : DOI : 10.1016/j.jmb.2014.03.002
Manos Mavrakis, Yannick Azou-Gros, Feng-Ching Tsai, José Alvarado, Aurélie Bertin, Francois Iv, Alla Kress, Sophie Brasselet, Gijsje H Koenderink, Thomas Lecuit (2013 Jun 10)

Septins promote F-actin ring formation by crosslinking actin filaments into curved bundles.

Nature cell biology : 322-34 : DOI : 10.1038/ncb2921
Manuela Dezi, Aurelie Di Cicco, Patricia Bassereau, Daniel Lévy (2013 Apr 15)

Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America : 7276-81 : DOI : 10.1073/pnas.1303857110
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