Le groupe « Mécanique et Génétique du Développement Embryonnaire et Tumoral » étudie le rôle des contraintes et déformations mécaniques des structures biologiques à l’échelle macroscopique cellulaire et multi-cellulaire, dans la régulation et la génération de processus biologiques actifs microscopiques à l’échelle moléculaire, incluant l’activation de moteurs moléculaires ou l’expression génique, in vivo. Le groupe se focalise sur le couplage entre contraintes mécaniques et signalisation biochimique en biologie du développement embryonnaire et tumoral.
Nos travaux vont de la modulation mécanique de l’endocytose de protéines de signalisation comme processus sous-jacent de mécanotransduction régulateur de la trans-différentiation cellulaire (2002), à son rôle comme signal mécanique d’activation de l’invagination du mésoderme dans l’embryon de Drosophile (2009, 2017).
Ils sont aussi basés sur notre découverte de la mécano-sensibilité de la voie β-caténine, impliquée dans l’induction mécanique de la différentiation précoce de l’endoderme antérieur de l’embryon de Drosophile (2003-2008), comme dans la possible origine évolutive de l’émergence du mésoderme dans le dernier ancêtre commun des bilatériens (2013), un processus réactivé de façon anormale comme signal tumorigène dans les cellules saines comprimées par la pression de croissance tumorale, in vivo (2015).
De nos recherches les plus récentes à nos premières recherches :
La gastrulation est activée mécanotransductionellement par de faibles fluctuations de forme cellulaires embryonnaires.
La gastrulation consiste en la formation de larges domaines de tissus qui internalisent l’embryon précoce souvent sous forme de tubes, et qui vont constituer les organes internes de l’animal adulte, tels que le tube digestif, ou encore le cœur, les muscles ou les reins et les poumons pour les organismes les plus complexes. Dans l’embryon de Drosophile, le premier de ces tubes, le mésoderme, donnera naissance à tous les organes internes de l’organisme adulte, excepté le tube digestif. Il se forme grâce à la stabilisation apicale (à la surface cellulaire extérieur de l’embryon) du moteur moléculaire Myo-II, ayant pour fonction de contracter la surface externe du tissu, et par là même d’induire la courbure du tissu vers l’intérieur pour former le tube de tissu interne mésodermal. Cette contraction se fait en deux temps. Dans un premier temps, les cellules contractent de façon erratique et instable, du fait de l’arrivée erratique et instable de spots de Myo-II sur les apex cellulaires. Puis, elles se contractent de façon stable et coordonnée, du fait de la stabilisation des spots de Myo-II qui arrivent progressivement sur les apex cellulaires.
Nous avons montré que les contraintes mécaniques développées par les fluctuations de forme cellulaires activent la stabilisation apicale de la Myo-II, donc déclenchent le processus actif d’invagination du mésoderme (Mitrossilis et al, Nature Communications 2017).
Pour ce faire, nous avons utilisé un mutant dont les cellules du mésoderme ne fluctuent plus, et ne montre de fait plus d’activation de l’invagination du mésoderme. Nous y avons mimé les fluctuations de forme des apex cellulaires dont l’amplitude est de l’ordre de 500 nanomètres seulement, par voie magnétique. En effet, nous avons injecté dans les cellules du mésoderme des liposomes magnétiques et avons approché à quelques petits microns un réseau de micro-aimants dont la taille individuelle, de 10 microns, est de l’ordre de la taille des cellules individuelles. Le champ magnétique local de ces micro-aimants ayant la particularité d’être modulable dans le temps, nous avons fait osciller les champs magnétiques micrométriques locaux, de telle sorte que les apexs des cellules se mettent à pulser, exactement comme dans l’embryon non muté (Figure 1-gauche). En réponse à cette stimulation mécanique, nous avons observé la stabilisation apicale de la Myo-II et le déclenchement de l’invagination du mésoderme (Figure 1-droite). Cette stimulation se fait par l’activation mécanique de réactions biochimiques, que nous avons identifié comme étant l’activation de la voie de signalisation Fog.
Qui plus est, nous avons montré, par voie magnétique encore, que les déformations mécaniques, cette fois provoquées par l’invagination du mésoderme sur les cellules de l’endoderme du pole postérieur de l’embryon (futur tube gastrique postérieur de l’embryon), y déclenchent la stabilisation apicale de la Myo-II et initient la formation du tube gastrique.
Les contraintes mécaniques de la gastrulation provoquent l’ouverture du site Y654 de la béta-caténine, site majeur d’interaction avec la E-cadhérine, initiant sa phosphorylation par Src42A puis l’activation de la voie de transduction menant à l’expression des gènes cibles de béta-caténine, comme twist.
Figure 2. a Simulation du complexe b-cat-E-cad sous contrainte mécanique de 6pN. b Application d’une contrainte mécanique mimant l’initiation de l’invagination du mésoderme par voie magnétique sur un embryon défectif en gastrulation (sna- twi-) et observation de la dilatation de 1nm autour du site Y654 b-cat par transfert de fluorescence entre les alpha-hélices de b-cat et E-cad connectées par le site. c Augmentation de l’accessibilité au site Y654 sous les contraintes de l’invagination par l’anticorps Y654-β-cat.
Les simulations prédisent en effet que sous l’effet d’une force de 6pN, les deux alpha-hélices connectées par l’interaction Y654-b-cat et D665-Ecad se dilatent de 1nm, et que le site Y654 a 15% de chance de s’ouvrir (Fig.2a). Une telle dilatation été confirmée quantitativement expérimentalement en FLIM en réponse à l’invagination du mésoderme (non montré) ou aux contraintes mécaniques associées, mimées par voie magnétique dans des embryons défectifs en gastrulation (Fig. 2b). Le site Y654 se trouve alors en effet rendu plus accessible à son anticorps spécifique sous contrainte, de l’ordre de 20% (Fig. 2c) – et ce encore plus, de façon cohérente, en absence de Src42A responsable de sa phosphorylation sous contrainte mécanique et de son relargage dans le cytosol pour transcription. Ceci favorise son relargage des jonctions (non montré) (Röper et al, e-LIFE 2018), et stimule le maintien de l’expression du gène twist au cours de l’invagination du mésoderme (voir partie « Evo-Devo » et « Biologie du Développement » ci-dessous, Desprat et al, Dev. Cell. 2008, Brunet, Bouclet et al, Nature Communications 2013).
Tumorigenèse : induction mécanique de la tumorigenèse dans les cellules saines comprimées, en réponse aux contraintes mécaniques développées par la croissance tumorale in vivo.
Nous avons trouvé l’induction mécanique de l’activation de la β-caténine et de l’expression des oncogènes sous contrôle, dans l’initiation de la tumorigenèse à la fois dans le colon pré-tumoral et le colon normal de souris, en réponse à la pression de croissance tumorale in vivo (M-E Fernandez-Sanchez, S. Barbier et al, Nature 2015, – Figure 3 ).
Pour ce faire, nous avons mimé la pression de croissance tumorale de 1kPa en incluant des liposomes ultra-magnétiques dans les cellules mésenchémiales du tissu conjonctif des cryptes du colon, auxquels nous avons appliqué un gradient de champ magnétique par insertion d’un aimant cylindrique millimétrique en sous-cutané face au colon. Cette contrainte a mené à l’activation de la phosphorylation du site Y654 d’un pool de béta-caténine inducteur de son relargage des jonctions vers le cytoplasme. Elle a de plus mené à la phosphorylation du site Ser9 de la GSK3b permettant la translocation de la beta-caténine cytoplasmique dans le noyau, puis à l’expression des gènes cibles tumoraux tels que c-Myc. Le même résultat a été observé dans les cellules des cryptes non tumorales comprimées par les cryptes tumorales hyper-prolifératives (exprimant Notch), dans un modèle de souris récapitulant le processus de progression tumorale.
Evo-Devo : une origine évolutive mécano-transductionelle à l’émergence du mésoderme dans le dernier ancêtre commun des animaux complexes, les bilatériens.
Nous avons trouvé que l’activation mécanique de la voie béta-caténine, induite de façon anormale dans le processus de développement tumoral, est une propriété ancestrale, probablement à l’origine de l’émergence de patterns de différentiation embryonnaires chez les organismes anciens, tels que l’émergence du mésoderme chez le dernier ancêtre commun des bilatériens. Nous avons en effet trouvé la conservation de l’induction mécanique de l’expression des gènes de différentiation précoce du mésoderme par le tout premier mouvement morphogénétique de l’embryogenèse, dans le poisson zèbre (vertébré) et dans la Drosophile (arthropode). Cette induction mécanique est initiée par l’activation mécanique de la phosphorylation du site Y654 de la béta-caténine inhibant son interaction avec la E-cadhérine, menant à son relargage dans le cytoplasme et le noyau, puis à l’expression des gènes cibles brackury and twist, premiers gènes de différentiation précoce du mésoderme (Figure 4).
Or, l’origine évolutive de l’émergence du mésoderme reste aujourd’hui une question ouverte importante de l’Evo-Devo. Nos résultats suggèrent que la phosphorylation du site Y654 de la béta-catenine en réponse au tout premier mouvement morphogénétique de l’embryogenèse soit à l’origine de l’émergence du mésoderme dans l’ancêtre commun des bilatériens, in y a 570 millions d’années (Bouclet, Brunet et al, Nature Comm. 2013).
Biologie du développement: couplage mécano-génétique et mécano-protéique réciproque dans la régulation du développement embryonnaire à la gastrulation.
Le développement embryonnaire consiste en la coordination de processus multi-cellulaires de différentiation cellulaire, et de morphogenèse biomécanique. Ces dernières décennies, le rôle du moteur moléculaire Myosine-II dans l’activation des processus de morphogenèse biomécanique a été caractérisé comme étroitement régulé par l’expression des gènes du développement de différentiation.
Nous avons révélé l’existence d’une régulation inverse, de l’activation de l’expression du gène de différentiation Twist (Figure 5) et de la relocalisation active de la Myosin-II (Figure 5), par les contraintes mécaniques développées par les mouvements morphogénétiques de la gastrulation. Cette régulation est générée par les processus de mécano-transduction impliquant l’activation mécanique de la beta-caténine et de la voie de signalisation Fog (associé à l’inhibition mécanique de l’endocytose de Fog, voir paragraphe suivant), respectivement.
Nous avons utilisé les outils expérimentaux (outils biophysiques et génétiques de modulation des mouvements morphogénétiques) (Figure 5,6), comme les outils théoriques (simulations intégrant les connaissance génétiques de la régulation de la morphogenèse) (Figure 7), pour découpler les paramètres de contrôle génétiques et mécaniques, dans la régulation de l’expression de Twist et de la localisation active de la Myosine-II. En particulier, nous avons mis en place une méthode de pinces magnétiques pour évaluer et contrôler les forces physiologiques impliquées dans la morphogenèse, afin de mimer les mouvements morphogénétiques endogènes de l’embryogenèse de l’intérieur du tissu embryonnaire vivant (Figure 5). Farge, Curr. Biol., 2003; Desprat et al, Dev Cell, 2008; Pouille et al Phys. Biol. 2008; Ahmadi, Pouille et al, Science Signalling, 2009.
Endocytose: force motrice de l’endocytose et modulation mécanique de l’endocytose comme processus mécanotransductionnel de transdifférentiation cellulaire.
Historiquement, la première thématique étudiée dans le groupe a été celle des propriétés motrices des membranes biologiques relevant de la physique de la matière molle dans la vésicularisation des membranes initiant le processus d’endocytose de la membrane plasmique (Rauch et al, Bioph. J, 2000), ainsi que le rôle de l’inhibition mécaniquement induite de l’endocytose de signaux morphogènes dans l’induction mécanique de la trans-différentiation cellulaire (Figure 8, Rauch et al, Am. J. Cell Phys, 2002)
