Diversité et plasticité des tumeurs de l’enfant

Olivier Delattre, directeur de l'unité Génétique et biologie des cancers - Institut Curie / Inserm U830.

Olivier Delattre Diversité et plasticité des tumeurs de l'enfant

Diversité et plasticité des tumeurs de l’enfant

Les cancers pédiatriques représentent la seconde cause de mortalité des enfants dans les pays développés. La plupart de ces tumeurs se développent à partir de tissus embryonnaires et représentent, contrairement aux tumeurs de l’adulte, des accidents du développement plutôt que des accidents liés au vieillissement ou au renouvellement tissulaire. Différentes caractéristiques distinguent les cancers de l’enfant des cancers de l’adulte et peuvent apparaître comme des éléments de relative simplicité pour étudier leurs mécanismes d’initiation et de progression: le faible nombre d’altérations génétiques qui expliquent probablement un rôle limité de l’instabilité génétique, la faible exposition des enfants aux facteurs mutagènes environnementaux et le développement très rapide de ces tumeurs qui suggèrent un nombre limité d’étapes de l’oncogenèse.

Nous avons pour objectif de définir les altérations moléculaires qui caractérisent les tumeurs pédiatriques et d’étudier leurs conséquences fonctionnelles dans le contexte cellulaire approprié. Les trois principaux groupes de tumeurs que nous étudions sont les sarcomes, et plus particulièrement les sarcomes d’Ewing, les tumeurs rhabdoïdes et les neuroblastomes. Ces dernières années nous avons participé à la découverte de leurs altérations génétiques principales, tel que la fusion EWSR1-FLI1, l’inactivation du gène SMARCB1, les fusions BCOR, et les mutations activatrices du gène ALK (Delattre et al, Nature 1992; Versteege et al, Nature, 1998; Janoueix-Lerosey et al, Nature, 2008; Pierron et al, Nat Genet, 2012, Watson et al, J Pathol, 2018). Ces anomalies moléculaires sont le point de départ pour mieux comprendre les processus spécifiques de développement de ces tumeurs, ainsi que pour mettre au point de nouveaux outils de diagnostic et de pronostic, et pour proposer de nouvelles options thérapeutiques. Ces projets sont menés en étroite collaboration avec nos collègues du département clinique du centre d’oncologie pédiatrique SIREDO et ceux de l’hôpital Curie.

Notre recherche s’articule autour de trois axes majeurs :

  • Les analyses fonctionnelles des gènes altérés à travers la mise au point de modèles biochimiques, cellulaires et animaux.
  • L’étude de l’hétérogénéité inter- et intra-tumorale, avec une attention particulière à la plasticité génétique et non génétique, qui peut être explorée grâce aux analyses de cellules uniques (single cell), au profilage épigénétique et aux approches d’imagerie sur les cellules du vivant. Nous nous intéressons aussi fortement à la détermination des cellules d’origine de ces cancers pour comprendre la biologie normale de ces cellules et leur reprogrammation en cellules cancéreuses.
  • L’investigation du lien entre les génomes germinaux et tumoraux, pour élucider comment les polymorphismes germinaux peuvent interagir avec les mutations acquises pour promouvoir l’oncogenèse.

Le sarcome d’Ewing

Hétérogénéité cellulaire et plasticité

Fig 1. Gauche) Schéma de l’hétérogénéité des cellules d’Ewing. Les cellules avec une faible activité d’EWSR1-FLI1 (bleu clair) ont des caractéristiques mésenchymateuses avec une fort potentiel migratoire et d’adhérence cellulaire. Droite) Analyse de RNA-seq sur cellule unique montrant que la prolifération (ordonnée) est associée à une fenêtre donnée d’activité d’EWSR1-FLI1 (abscisse)
Fig 1. Gauche) Schéma de l’hétérogénéité des cellules d’Ewing. Les cellules avec une faible activité d’EWSR1-FLI1 (bleu clair) ont des caractéristiques mésenchymateuses avec un fort potentiel migratoire et d’adhérence cellulaire. Droite) Analyse de RNA-seq sur cellules uniques montrant que la prolifération (ordonnée) est associée à une fenêtre donnée d’activité d’EWSR1-FLI1 (abscisse)

Le sarcome d’Ewing est caractérisé la plupart du temps par l’expression d’une protéine de fusion associant le domaine « Prion-like » d’EWSR1 et le site de fixation à l’ADN de FLI1. Nous avons récemment démontré que le niveau d’expression de cet oncogène varie au sein des tumeurs et impacte le comportement cellulaire. Les cellules EWSR1-FLI1faible ont un phénotype mésenchymateux avec de fortes capacités d’invasion et de migration, alors que les cellules EWSR1-FLI1fort prolifèrent activement. Il existe par ailleurs une plasticité cellulaire entre ces 2 états (Franzetti GA et al., Oncogene, 2017). Une évaluation plus en profondeur des cellules d’Ewing au niveau de la cellule unique montre que ces cellules ont un large spectre d’activité d’EWSR1-FLI1 et que la prolifération est associée à une fenêtre bien définie de cette activité (IC-EWSOPT sur la Fig.1)(Aynaud et al, Cell reports, 2020). Nous nous intéressons maintenant aux facteurs intrinsèques ou extrinsèques à la cellule qui contrôlent l’activité d’EWSR1-FLI1.

Étude des mutations STAG2

Fig 2. Schéma des effets de l’inactivation de STAG2 dans les cellules d’Ewing. La baisse d’activité d’EWSR1-FLI1 observée lors de l’inactivation de STAG2 est associée à une augmentation de la prolifération et de l’invasion.
Fig 2. Schéma des effets de l’inactivation de STAG2 dans les cellules d’Ewing. La baisse d’activité d’EWSR1-FLI1 observée lors de l’inactivation de STAG2 est associée à une augmentation de la prolifération et de l’invasion.

STAG2 est l’un des gènes les plus couramment mutés dans les cancers humains, et la seconde altération génétique la plus fréquente dans le sarcome d’Ewing (après EWS-FLI1). Les mutations de STAG2 sont associées à un mauvais pronostic chez les patients atteints d’un sarcome d’Ewing. (Tirode, Surdez et al., Cancer Discovery, 2014). STAG2 fait partie du complexe de la cohésine, une structure multiprotéique en forme d’anneau, qui joue un rôle important dans la cohésion des chromatides sœurs et de leur séparation lors de la mitose. La cohésine, associée avec CTCF, a aussi un rôle essentiel dans l’architecture du génome, permettant de former des boucles de chromatine. Nous avons exploré la fonction de STAG2 grâce à la mise au point de modèles d’Ewing déficients pour cette protéine, ainsi qu’à l’utilisation du séquençage haut débit permettant d’étudier la structure 3D du génome (HiChIP). Nous avons montré que l’inactivation de STAG2 altère l’ancrage lors du processus d’extrusion des boucles d’ADN et diminue drastiquement les interactions promoteur/enhanceur, particulièrement celles impliquant des microsatellites GGAA fixés par la protéine de fusion EWSR1-FLI1 (Surdez et al, Cancer Cell, 2021).

Interactions entre les altérations germinales et somatiques

Fig 3. Graphique de Manhattan des résultats de l’étude GWAS dans les sarcomes d’Ewing mettant en évidence 6 locus.
Fig 3. Graphique de Manhattan des résultats de l’étude GWAS dans les sarcomes d’Ewing mettant en évidence 6 locus.

Le sarcome d’Ewing est majoritairement observé dans les populations d’origine européenne, ce qui a fortement suggéré l’existence d’une susceptibilité génétique. En collaboration avec les groupes de Chanock et Machiella au NCI, nous avons réalisé une étude GWAS de patients d’Ewing qui a montré une forte association statistique du sarcome d’Ewing avec six locus génomiques (Postel-Vinay et al, Nature Genetics, 2012; Machiela et al, Nature Communication, 2018). Une investigation plus en profondeur du locus situé sur le chromosome 10 a montré que l’allèle à risque présente un polymorphisme dans une séquence GGAA qui est liée par EWSR1-FLI1 pour réguler le gène EGR2, gène essentiel dans le sarcome d’Ewing (Grunewald et al, Nature Genetics, 2015). Nous étudions actuellement d’autres locus de susceptibilité au sarcome d’Ewing.

Nouvelles approches thérapeutiques

Actuellement, nous étudions les mécanismes impliqués dans la transition entre les cellules EWSR1-FLIfaible et EWSR1-FLIfort pour mieux comprendre les mécanismes de résistance aux traitements. De plus, nous développons des modèles cellulaires exprimant la protéine endogène d’EWSR1-FLI1 fusionnée avec une protéine fluorescente pour étudier l’impact des composés pharmaceutiques sur la stabilité de la protéine en collaboration avec la plateforme de criblage cellulaire à haut-contenu (Biophenics, Institut Curie).

Le neuroblastome

Hétérogénéité et plasticité de l’identité cellulaire

Fig 4. Analyse de l’immunofluorescence des cellules NOR et MES dans le neuroblastome. Les cellules MES sont CD44 positives avec des fibres de stress bien organisées, alors que les cellules NOR ne présentent pas de telles caractéristiques
Fig 4. Analyse de l’immunofluorescence des cellules NOR et MES dans le neuroblastome. Les cellules MES sont CD44 positives avec des fibres de stress bien organisées, alors que les cellules NOR ne présentent pas de telles caractéristiques

La plasticité des cellules cancéreuses est maintenant identifiée comme un mécanisme contribuant à l’hétérogénéité intra-tumorale et aux échecs de traitement dans différents types de cancer. Le neuroblastome, une tumeur dérivée des cellules multipotentes de la crête neurale (NCC=Neural Crest Cells), cause environ 15% des décès d’enfants associés au cancer. Grâce à l’étude de régions régulatrices appelées « Super-Enhancers », nous avons pu récemment mettre en évidence deux types d’identité cellulaire : une identité noradrénergique (NOR) déterminée par les facteurs de transcription PHOX2B, HAND2 et GATA3, et une identité mésenchymateuse (MES) caractérisée pas les facteurs de transcription de la famille AP-1 (Boeva et al, Nature Genetics, 2017). Les cellules MES sont moins sensible à la chimiothérapie. Des travaux récents montrent que certaines cellules de neuroblastome présentent une plasticité et peuvent basculer d’une identité mésenchymateuse (MES) à une identité noradrénergique (NOR) et vice versa.  Un de nos principaux objectifs est de comprendre les mécanismes qui contrôlent la reprogrammation de l’identité cellulaire du neuroblastome et de définir les voies de signalisation impliquées dans les cellules noradrénergiques et mésenchymateuses, ainsi que dans la transition NOR-MES. Des résultats récents montrent qu’à la fois les signaux environnementaux externes et les facteurs intrinsèques contrôlent la plasticité et l’identité cellulaire du neuroblastome. En particulier, une lignée cellulaire dérivée d’un modèle PDX (établi à partir d’un patient de stade 4 en rechute) composée exclusivement de cellules NOR in vivo peut proliférer in vitro sous forme d’une population bi-phénotypique, avec des cellules adhérentes et des neurosphères flottantes, des expériences de RNA-seq sur cellules uniques (scRNA-seq) prouvant les identités MES et NOR, respectivement (Figure 4). Nous étudions en profondeur par le biais de scRNA-seq et de la manipulation génétique les mécanismes de la transition NOR vers MES qui peuvent être cruciaux pour expliquer les échecs de traitement.

Décrypter le microenvironnement tumoral du neuroblastome

Fig 5. Analyse du transcriptome sur cellules uniques du modèle neuroblastome murin TH-MYCN. UMAP de 5650 cellules après intégration avec Seurat de trois tumeurs analysées par scRNA-seq.
Fig 5. Analyse du transcriptome sur cellules uniques du modèle neuroblastome murin TH-MYCN. UMAP de 5650 cellules après intégration avec Seurat de trois tumeurs analysées par scRNA-seq.

Nous avons récemment exploré des biopsies de patients par scRNA-seq (technologie 10X Genomics disponible sur la plateforme NGS de l’Institut Curie) pour étudier à la fois l’hétérogénéité des cellules tumorales et le microenvironnement du neuroblastome. En parallèle, nous caractérisons les tumeurs de souris générées dans le modèle transgénique TH-MYCN, qui constitue un modèle préclinique de neuroblastome dans un fond immunocompétent. Dans ces analyses, les populations cellulaires sont annotées selon l’expression de marqueurs canoniques de type cellulaire et / ou de signatures connues. Nous explorons les similitudes dans la structure des populations entre les deux organismes en mettant l’accent sur les populations myéloïdes et les fibroblastes associés au cancer (CAFs). Les interactions entre différentes populations du microenvironnement et / ou avec les cellules tumorales sont analysées à l’aide d’outils bio-informatiques et d’analyses fonctionnelles, afin de mieux définir des thérapies ciblant à la fois le microenvironnement et les cellules tumorales.

Rôle de la surexpression de MYCN et des mutations Alk dans la tumorigenèse

En 2008, l’identification de mutations activatrices du gène ALK dans un sous-ensemble de neuroblastomes sporadiques et familiaux (Mossé et al, Chen et al, George et al, Janoueix-Lerosey et al, Nature, 2008) a constitué une avancée majeure dans la compréhension de la maladie et a ouvert la voie à des traitements ciblés. Le gène ALK code pour un récepteur de tyrosine kinase (RTK) qui est préférentiellement exprimé dans le système nerveux central et périphérique. Pour mieux comprendre les premiers stades de la tumorigenèse, nous explorons comment la surexpression du gène MYCN (qui est amplifié dans 20% des tumeurs primaires) et / ou les mutations du gène Alk modifient le développement de la glande surrénale et des écosystèmes des ganglions sympathiques. Ce travail est réalisé à l’aide de modèles murins, en tirant parti des approches scRNA-seq combinées à l’imagerie multiplexée.

Les sarcomes

Les sarcomes consistent en un groupe rare de tumeurs malignes d’origine mésenchymateuse. Ils se caractérisent par des hétérogénéités cliniques, pathologiques et moléculaires. D’un point de vue pathologique, plus de 150 sous-types de sarcome ont été décrits, et cette classification s’est même élargie au cours des dernières décennies en raison de la découverte de multiples anomalies moléculaires spécifiques à certains groupes de tumeurs. Nos projets de recherche s’articulent autour de trois axes principaux.

Caractérisation génomique et transcriptomique des sarcomes

Nous utilisons des approches de séquençage de nouvelle génération (WES, RNA-seq) pour étudier les caractéristiques génétiques et transcriptomiques des sarcomes, identifier de nouvelles entités tumorales et caractériser leurs propriétés tumorales et immunitaires, ainsi que pour développer des outils bio-informatiques pour le diagnostic.

Hétérogénéité intra-tumorale des sarcomes des tissus mous de haut grade

Nous étudions également l’hétérogénéité intra-tumorale de sarcome spécifique de haut grade tel que le liposarcome dédifférencié et le sarcome pléomorphe indifférencié par séquençage à cellules uniques (scRNA-seq). L’objectif est d’étudier les mécanismes biologiques conduisant à l’existence de populations de cellules tumorales distinctes au sein de ces tumeurs, ainsi que leurs interactions avec le microenvironnement tumoral afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Décrypter la cellule d’origine des sous-types de sarcomes

Il est supposé que la plupart des sous-types de sarcomes dérivent de la transformation de cellules souches mésenchymateuses (MSC=Mesenchymal Stem Cells) à divers stades de différenciation. Nous effectuons un profilage épigénétique et transcriptomique approfondi d’une cohorte de divers sous-types de sarcomes pour identifier les spécificités liées à leur cellule d’origine possible. À cette fin, des profils tumoraux sont intégrés et combinés avec des profils épigénétiques et transcriptomiques de cellules et de tissus mésenchymateux bénins. L’objectif est de déterminer le contexte cellulaire dans lequel des altérations génomiques spécifiques peuvent conduire au développement de ces tumeurs.

Tous ces projets visent à développer de nouvelles approches thérapeutiques et à améliorer la santé des patients.

Publications clés

Année de publication : 2021

Olivier Saulnier, Katia Guedri-Idjouadiene, Marie-Ming Aynaud, Alina Chakraborty, Jonathan Bruyr, Joséphine Pineau, Tina O'Grady, Olivier Mirabeau, Sandrine Grossetête, Bartimée Galvan, Margaux Claes, Zahra Al Oula Hassoun, Benjamin Sadacca, Karine Laud, Sakina Zaïdi, Didier Surdez, Sylvain Baulande, Xavier Rambout, Franck Tirode, Martin Dutertre, Olivier Delattre, Franck Dequiedt (2021 May 19)

ERG transcription factors have a splicing regulatory function involving RBFOX2 that is altered in the EWS-FLI1 oncogenic fusion.

Nucleic acids research : DOI : 10.1093/nar/gkab305
Didier Surdez, Sakina Zaidi, Sandrine Grossetête, Karine Laud-Duval, Anna Sole Ferre, Lieke Mous, Thomas Vourc'h, Franck Tirode, Gaelle Pierron, Virginie Raynal, Sylvain Baulande, Erika Brunet, Véronique Hill, Olivier Delattre (2021 Apr 30)

STAG2 mutations alter CTCF-anchored loop extrusion, reduce cis-regulatory interactions and EWSR1-FLI1 activity in Ewing sarcoma.

Cancer cell : DOI : 10.1016/j.ccell.2021.04.001

Année de publication : 2020

Marie-Ming Aynaud, Olivier Mirabeau, Nadege Gruel, Sandrine Grossetête, Valentina Boeva, Simon Durand, Didier Surdez, Olivier Saulnier, Sakina Zaïdi, Svetlana Gribkova, Aziz Fouché, Ulykbek Kairov, Virginie Raynal, Franck Tirode, Thomas G P Grünewald, Mylene Bohec, Sylvain Baulande, Isabelle Janoueix-Lerosey, Jean-Philippe Vert, Emmanuel Barillot, Olivier Delattre, Andrei Zinovyev (2020 Feb 13)

Transcriptional Programs Define Intratumoral Heterogeneity of Ewing Sarcoma at Single-Cell Resolution.

Cell reports : 30 : 1767-1779.e6 : DOI : 10.1016/j.celrep.2020.01.049

Année de publication : 2019

Angela Bellini, Nadia Bessoltane-Bentahar, Jaydutt Bhalshankar, Nathalie Clement, Virginie Raynal, Sylvain Baulande, Virginie Bernard, Adrien Danzon, Mathieu Chicard, Léo Colmet-Daage, Gaelle Pierron, Laura Le Roux, Julien Masliah Planchon, Valérie Combaret, Eve Lapouble, Nadège Corradini, Estelle Thebaud, Marion Gambart, Dominique Valteau-Couanet, Jean Michon, Caroline Louis-Brennetot, Isabelle Janoueix-Lerosey, Anne-Sophie Defachelles, Franck Bourdeaut, Olivier Delattre, Gudrun Schleiermacher (2019 Apr 25)

Study of chromatin remodeling genes implicates SMARCA4 as a putative player in oncogenesis in neuroblastoma.

International journal of cancer : 145 : 2781‑91 : DOI : 10.1002/ijc.32361

Année de publication : 2018

Watson, S., Perrin, V., Guillemot, D., Reynaud, S., Coindre, J.-M., Karanian, M., Guinebretière, J.-M., Freneaux, P., Le Loarer, F., Bouvet, M., Galmiche-Rolland, L., Larousserie, F., Longchampt, E., Ranchere-Vince, D., Pierron, G., Delattre, O., and Tirode, F (2018 Mar 30)

Transcriptomic definition of molecular subgroups of small round cell sarcomas

The Journal of Pathology : 245 : 29, 40 : DOI : doi.org/10.1002/path.5053

Année de publication : 2017

Céline Chauvin, Amaury Leruste, Arnault Tauziede-Espariat, Mamy Andrianteranagna, Didier Surdez, Aurianne Lescure, Zhi-Yan Han, Elodie Anthony, Wilfrid Richer, Sylvain Baulande, Mylène Bohec, Sakina Zaidi, Marie-Ming Aynaud, Laetitia Maillot, Julien Masliah-Planchon, Stefano Cairo, Sergio Roman-Roman, Olivier Delattre, Elaine Del Nery, Franck Bourdeaut (2017 Nov 16)

High-Throughput Drug Screening Identifies Pazopanib and Clofilium Tosylate as Promising Treatments for Malignant Rhabdoid Tumors.

Cell reports : 1737-1745 : DOI : S2211-1247(17)31539-5
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