UMR9187 / U1196 – Chimie et Modélisation pour la Biologie du Cancer (CMBC)

Thèses

2021

Les approches de chimie combinatoire pour le développement des ligands de G-quadruplexes de l’ADN et de l’ARN
Oksana Reznichenko

Résumé

Les G-quadruplexes (G4s) sont des structures non-canoniques d’acides nucléiques (ADN et ARN) constituées d’au moins deux quartets de guanines. L’une des propriétés importantes des G4s est leur capacité à former des complexes avec de petites molécules exogènes (ligands) et d’influencer ainsi les processus biologiques dans lesquels ils sont impliqués. Ainsi, l’interaction de petites molécules avec certaines structures G4s permettrait de diminuer l’expression de certains oncogènes, d’inhiber la télomérase ou encore d’induire des dommages à l’ADN. Ce travail vise à développer des méthodologies rapides et simples pour la synthèse et le criblage des molécules afin d’identifier des ligands sélectifs et affins de structures non-canoniques d’acides nucléiques, en particulier des G4s. Plus précisément, ce travail explore la synthèse réversible d’acylhydrazones, jusqu’ici peu appliquée pour le développement de ligands de l’ADN et de l’ARN. Dans un premier temps, une série de 20 bis(acylhydrazones), analogues des ligands PDC (360A) et PhenDC3, a été obtenue par la synthèse préparative. Les expériences de dénaturation thermique suivie par fluorescence ont démontré que certains de ces composés avaient une bonne affinité pour l’ADN G4. Ces expériences ont permis de valider le potentiel du motif acylhydrazone pour le développement de ligands des G4s. Ensuite, une méthode de chimie dynamique combinatoire (CDC) a été développée. Cette dernière consiste en génération de bibliothèques combinatoires comportant jusqu’à 20 composés, suivie par l’isolement des ligands les plus affins par la précipitation avec la cible, immobilisée sur des billes magnétiques. Ainsi, un bis(acylhydrazone) non-symétrique a été identifié comme un ligand prometteur du G4 parallèle Pu24T. Cependant, les expériences avec ses proches analogues n’ont pas confirmé son affinité aux G4 augmentée par rapport aux dérivés symétriques. Il a été supposé que les résultats d’expériences de CDC pouvaient être biaisés par des interactions non-spécifiques entre les ligands et les billes magnétiques. Pour améliorer l’analyse des bibliothèques combinatoires, une nouvelle méthode basée sur l’extraction en phase solide des ligands a été développée et appliquée à deux bibliothèques d’acylhydrazones non-symétriques. Huit hits ont été obtenus à partir de 70 composés générés in situ. Trois d’entre eux ont été sélectionnés pour la synthèse préparative et une étude de l’interaction avec l’ADN G4. En parallèle, une approche classique de chimie combinatoire a été élaborée, ce qui a conduit à la génération d’une bibliothèque combinatoire de 90 dérivés bis(acylhydrazone) sous forme de solutions 2 mM dans DMSO prêtes à l’emploi, avec une pureté moyenne de 87%. Ces échantillons ont été utilisés directement dans le criblage biophysique contre quatre G4s de l’ADN de trois topologies différentes. Les composés les plus actifs ont été synthétisés d’une manière préparative et leur interaction avec les G4s a été étudiée en détail par des méthodes biophysiques, y compris la spectrométrie de masse native. Ainsi, au moins un dérivé avec une affinité pour les G4s supérieure à celle de PhenDC3 et une sélectivité inédite pour le G4 antiparallèle a été identifié. Enfin, dans le cadre d’un projet collaboratif (M. Blondel, Université de Bretagne Occidentale), des ligands synthétisés au cours de ce travail ont été étudiés vis-à-vis de leur capacité à moduler d’évasion immune du virus d’Epstein–Barr (EBV). Il a été démontré que certains bis(acylhydrazones) interagissent in vitro avec la séquence riche en guanines de l’ARNm codante pour le domaine riche en glycine-alanine (GAr) de la protéine virale EBNA1. Deux de ces dérivés déplacent le facteur de la cellule hôte (nucléoline) de l’ARNm d’EBNA1, conduisant ainsi à la surexpression de la protéine et à la présence exacerbé de peptides antigéniques sur les cellules infectées. Cet effet représente une opportunité thérapeutique pour le traitement des cancers associés à l’EBV. (Soutenue le 26 mars 2021)

2020

Targeting TYRO3 : A novel strategy to radiosensitise bladder cancer cells
Linda Silina

Résumé

Le cancer de la vessie est un problème majeur de santé publique. Il est le quatrième cancer le plus fréquent chez l’homme en termes d’incidence. 25% des cancers diagnostiqués sont des tumeurs envahissant le muscle (TVIM) présentant un mauvais pronostic. La cystectomie est le traitement standard de référence pour les TVIM, même si elle présente des inconvénients importants. La radiothérapie, associée à une chimiothérapie et à une résection transurétrale de la tumeur, émerge comme traitement conservateur alternatif. La chimiothérapie n’épargne pas les tissus sains et présentent de nombreux effets secondaires indésirables. Il est donc d’importance de découvrir de nouvelles stratégies de radiosensibilisation pour les tumeurs de la vessie. TYRO3 est un récepteur à activité tyrosine kinase de la famille TAM (qui comprend TYRO3, AXL et MERTK). TYRO3 est surexprimé dans de nombreux types de cancers et favorise la prolifération, la survie et la résistance des cellules tumorales à la chimiothérapie. De plus, la surexpression de TYRO3 a été associée à une diminution de la survie globale des patients. Cependant, le rôle de TYRO3 dans le cancer de la vessie n’a pas encore été étudié. Dans cette thèse, je me suis intéressée : (1) Au rôle de TYRO3 dans le cancer de la vessie; (2) A l’effet radiosensibilisant de la perte d’expression ou de l’inhibition de TYRO3 dans les cellules cancéreuses de la vessie; (3) A l’effet de l’inhibition ou de la perte d’expression de TYRO3 sur l’urothélium humain sain.Nous avons démontré que TYRO3 est surexprimé dans 50% des TVIM. De plus, nous avons mis en évidence que les cellules tumorales de vessie surexprimant TYRO3 développaient une dépendance à ce récepteur pour leur survie et leur croissance. Les résultats des données transcriptomiques suggèrent que la perte d’expression de TYRO3 induit des modifications importantes dans le contrôle du cycle cellulaire et de l’apoptose, ce qui laisse supposer que TYRO3 pourrait augmenter la sensibilité de ces tumeurs à la radiothérapie. La perte d’expression ou l’inhibition de TYRO3 dans les cellules dérivées de tumeur de vessie induit une radiosensibilisation significative des cellules traitées. A l’inverse, la surexpression de TYRO3 par transfection plasmidique sur des cellules exprimant peu TYRO3 induit une radiorésistance. En association avec le rayonnement, la perte d’expression de TYRO3 conduit à un arrêt du cycle cellulaire et à une persistance à 24h des foyers de réparation (détectés par immunofluorescence). Enfin, les travaux sur les cellules dérivées de l’urothélium sain ont montré que la perte d’expression de TYRO3 n’affectait pas leur viabilité suggérant que le ciblage de TYRO3 pourrait améliorer l’efficacité de la radiothérapie tout en épargnant les tissus normaux environnants. (Soutenue le 15 octobre 2020)

Inhibiteurs photo-contrôlables de la famille TAM – Méthodologie de sulfénylation directe d’imidazopyridines
Julie Le Bescont

Résumé

La famille TAM regroupe trois tyrosines kinases transmembranaires : Tyro3, Axl et Mer. Ces trois protéines sont impliquées dans de nombreux mécanismes de signalisation et de régulation cellulaire, notamment de croissance et d’apoptose. La famille TAM a été identifiée comme nouvelle cible thérapeutique prometteuse dans le traitement de certains cancers, de maladies auto-immunes et d’infections virales. Toutefois, il n’existe que peu de molécules ayant été spécialement conçues comme inhibiteurs de TAM, la plupart s’intéressant à Axl ou Mer. La première partie de ce manuscrit est consacrée à l’optimisation d’inhibiteurs de TAM basés sur le noyau imidazo[4,5-b]pyridine. La conception par modélisation moléculaire, la synthèse et l’évaluation biologique seront discutées. Pour contourner les problèmes de sélectivité inhérents aux protéines kinases, nous avons choisi d’appliquer le concept de la photopharmacologie. Cette stratégie permet de contrôler spatialement et temporellement l’activité de la drogue uniquement dans la zone à traiter par l’utilisation de la lumière, et donc d’éviter les effets secondaires. L’approche utilisant les groupements photo-labiles (GPL) consiste à masquer une fonction chimique importante pour l’activité thérapeutique, ce qui rend la molécule temporairement inactive. L’irradiation du composé induit le clivage du groupement et ainsi la restauration de l’activité inhibitrice. Nous avons introduit différents groupements photo-labiles (GPL) sur l’azote N3 de nos inhibiteurs. Le choix du groupement, la synthèse, l’étude du photo-clivage et l’évaluation biologique des composés seront présentés dans le deuxième chapitre. Enfin, nous avons développé une méthodologie de sulfénylation directe d’imidazopyridines utilisant le DABCO.(SO2)2, un précurseur de dioxyde de soufre comme source de soufre. (Soutenue le 13 octobre 2020)

Décrypter les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent l’activité de radiosensibilisation de complexes métalliques : vers le développement de candidats médicaments pour améliorer la radiochimiothérapie pour le traitement du cancer
Deepanjan Ghosh

Résumé

Les radiosensibilisants sont des agents qui rendent les cellules cancéreuses plus sensibles à l’irradiation en ciblant leurs voies de réparation de l’ADN, la régulation du cycle cellulaire, la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), etc. Ils sont utilisés dans quelques types de radiothérapie. Certains de ces radiosensibilisants sont des ligands de l’ADN produisant des dommages à l’ADN tels que des complexes métalliques ou des ligands de structure G-quadruplex (G4). Pt-ctpy est un complexe de platine ligand de G4 qui a montré des propriétés de radiosensibilisation (RS) via un ciblage proposé des télomères. Par conséquent, nous avons essayé d’identifier les déterminants structuraux pour une RS (ligand G4 et/ou métal). Un criblage cellulaire de RS a donc été effectué, avec des complexes métalliques ligands ou non de G4 de trois séries, terpyridine, salphène et des complexes de platine N-hétérocycliques-Carbene (NHC-Pt) conjugués au ligand Pyridodicarboxamide PDC, ainsi que d’autres complexes de platine comprenant le cisplatine et des complexes NHC-Pt. Le potentiel RS de ces complexes a été testé à leurs concentrations subtoxiques combinées au rayonnement γ (IR) dans trois lignées de cellule différentes (ovaire, poumon et glioblastome). Seuls Pt-ttpy de la série des métal-terpyridines, 2 métal-salphènes (Ni et Cu) et 6 complexes NHC-Pt sont capables d’induire la RS dans les lignées cellulaires. La RS ne suit pas une relation d’activité de structure puisque, 1) tous les ligands métalliques de G4 et 2) tous les métaux n’induisent pas de RS. Les complexes Pt-NHC font l’objet d’un brevet pour leur structure et leur potentiel de radiosensibilisation. Des études mécanistiques ont été poursuivies pour le complexe ligand de G4, Pt-ttpy qui cible les télomères, se lie irréversiblement à l’ADN et induit également un dysfonctionnement mitochondrial. Les pré-requis pour son activité RS sont très différents de ceux des NHC-Pt et du cisplatine. Sa RS dépend du temps de pré-incubation qui a pu être corrélée à la quantité de Pt liée à l’ADN. La présence de Pt-ttpy post-irradiation est également indispensable suggérant que la réparation des dommages à l’ADN induits par l’IR peut être perturbée par la présence d’un adduit de Pt-ttpy. Cela a été corrélé à 1) un retard dans la réparation précoce et une augmentation des dommages à l’ADN jusqu’à 6 heures après irradiation 2) une faible augmentation des dommages aux télomères et 3) une diminution des cellules en phase G2-M aux premiers stades post-irradiation, suggérant une mauvaise réparation de l’ADN génomique et télomérique. La RS est également indépendante de la production de ROS et de la présence de dommages télomériques pré-irradiation. Tous les résultats nous amènent à émettre l’hypothèse d’un mécanisme d’action pour la RS de Pt-ttpy, principalement axé sur le retard de la réparation des dommages à l’ADN dus à l’IR. Nous proposons que lorsque l’adduit encombrant à l’ADN de Pt-ttpy, présent avant irradiation et formé après irradiation, est situé près des dommages à l’ADN induits par l’IR, il se forme un dommage à l’ADN complexe plus difficile à réparer et qui conduirait à la mort cellulaire. De plus, Pt-ttpy est également capable d’induire une chimio sensibilisation aux inhibiteurs de la signalisation « DNA Damage Response » (ATM, ATR, DNA-PK) et à un inhibiteur de PARP1, protéine impliquée dans plusieurs voies de réparation d’ADN, mettant en évidence sa valeur dans une approche chimio-thérapeutique combinatoire et l’implication des adduits de Pt-ttpy à l’ADN dans sa cytotoxicité. En conclusion, ce projet met en évidence de nouvelles propriétés pour le complexe métallique ligand de G4, Pt-ttpy, qui sont différentes de celles du cisplatine et de Pt-ctpy, ce qui ouvre la voie à une sélection de nouveaux complexes métalliques dotés de propriétés de ciblage radiosensibilisant, chimiosensibilisant et mitochondrial. (Soutenue le 22 septembre 2020)

2019

Développements méthodologiques et informatiques pour la microscopie électronique en transmission appliqués à des échantillons biologiques
Amandine Verguet

Résumé

La compréhension de fonctions biologiques passe par la caractérisation ultra-structurale des cellules et complexes macromoléculaires. La microscopie électronique en transmission (TEM) ouvre l’accès aux structures tridimensionnelles des composantes structurales biologiques; la tomographie électronique est de nos jours l’outil de choix pour réaliser la caractérisation à haute résolution de structures uniques telles que les organelles. Cependant, afin d’acquérir des images de qualité suffisante pour obtenir des reconstructions tridimensionnelles à très haute résolution, il faut maîtriser la dose d’électrons utilisée pour imager l’échantillon sans l’endommager. Il est pour cela important d’améliorer les méthodes actuelles d’acquisition, afin de pouvoir observer les échantillons sensibles aux doses d’électrons avec un contraste satisfaisant. Depuis des années, l’acquisition en énergie filtrée (EF-TEM) permet d’améliorer le contraste des échantillons biologiques. Le mode STEM quant à lui permet d’obtenir des images d’échantillons épais tout en limitant la dose reçue par zone, grâce à son mécanisme de balayage. Une possibilité qui s’offre à nous est d’évaluer la combinaison de ces deux techniques. Une autre piste est l’amélioration des techniques d’alignement de données tomographiques bruitées, en particulier lorsque les marqueurs externes habituellement utilisés sont répartis de façon non-homogène. D’autre part, dans d’autres modes d’imagerie (IRM par exemple), depuis quelques années est apparue la possibilité de faire des acquisitions « sparse ». Il s’agit d’acquisitions aléatoires d’une partie retreinte des pixels de l’image. L’acquisition parcimonieuse est réalisable en mode STEM. Il reste cependant à caractériser ce type d’acquisition, déterminer comment utiliser les images obtenues en tomographie et enfin évaluer sa pertinence sur des échantillons biologiques. (Soutenue le 6 décembre 2019)

Ligands macrocycliques de sites abasiques en tant qu’inhibiteurs de la réparation de l’ADN : Synthèse, études biochimiques et biologiques
Coralie Caron

Résumé

Dans le contexte de la chimiothérapie, la réparation de l’ADN réduit les dommages induits par les agents alkylants de l’ADN dont le témozolomide (TMZ), conduisant à la chimiorésistance. Une des voies principales de réparation de l’ADN est la voie par excision de base (BER) au sein de laquelle une enzyme clée, APE1 (endonucléase AP 1), clive les sites abasiques générés suite aux traitements par les agents alkylants et initie la réparation de la coupure simple-brin. Ce mécanisme représente une source majeure de chimiorésistance dans certains cancers. Plusieurs études ont ainsi validé la voie BER et plus particulièrement APE1 comme une cible importante dans le but d’améliorer l’efficacité des agents anticancéreux; pour ces raisons, de nombreux inhibiteurs d’APE1 ont été développés. Cependant, à la place d’une inhibition directe de l’enzyme, une stratégie alternative consiste à cibler le substrat de cette dernière : les sites abasiques. Les composés macrocycliques de type naphtalénophane ont montré la capacité à se lier fortement et sélectivement aux sites abasiques. Ce processus interfère avec la reconnaissance de ces derniers par APE1 et conduit in vitro à deux effets : l’inhibition du clivage enzymatique d’APE1 et le clivage du site AP par les macrocycles par un mécanisme différent de celui d’APE1, de type β-élimination. Ainsi, une nouvelle série de naphtalénophanes fonctionnalisés, composée de neuf nouveaux dérivés, a été synthétisée et étudiée. La plupart des macrocycles démontre la capacité à se lier fortement et sélectivement aux sites abasiques de l’ADN ainsi qu’à inhiber l’activité d’APE1 in vitro, avec des constantes d’inhibition s’étalant de 39 nM à 25 µM. De plus, l’activité d’inhibition d’APE1 par les ligands, caractérisée par les valeurs de Kı, a pu être corrélée avec leur affinité et leur sélectivité pour les sites abasiques. La structure moléculaire des macrocycles montre une forte influence sur l’activité de clivage de ces derniers pouvant conduire à une abolition ou à une très haute activité de clivage des sites abasiques. De façon intéressante, la formation d’un adduit covalent ADN – ligand avec un des macrocycles a été caractérisée. Enfin, l’activité biologique des naphtalénophanes sur la lignée cellulaire de glioblastome T98G résistante au TMZ a été étudiée. La plupart des ligands affiche une cytotoxicité élevée, avec des GI₅₀ de l’ordre du micromolaire. De plus, un remarquable effet synergique lors du traitement des cellules avec le TMZ et le MMS en combinaison avec un ligand (2,7-BisNP-O4Me) a été démontré. Ce macrocycle augmente également le nombre de sites abasiques et le nombre de coupures double-brins après un co-traitement cellulaire avec les agents alkylants suggérant ainsi l’inhibition d’APE1 attendue. Ces résultats mettent ainsi en évidence le fort intérêt thérapeutique de ce composé. (Soutenue le 18 octobre 2019)

Capture cérébrale de chélates de gadolinium : imagerie multimodale et analyse des conséquences neurotoxicologiques
Marlène Rasschaert

Résumé

Les chélates de Gd sont largement utilisés en tant qu’agents de contraste en imagerie par résonance magnétique. En 2015, un lien a été établi entre l’observation d’hypersignaux T1 de certaines structures cérébrales et le nombre d’administrations préalables de ces chélates de Gd reçues par les patients. Cette observation fortuite pose la question de la tolérance à long-terme de ces molécules. L’ion Gd³⁺ ayant un rayon ionique très proche de celui du Ca²⁺, il interfère avec de nombreux processus biologiques Ca²⁺-dépendants. Sa chélation par un ligand améliore considérablement sa tolérance. Les chélates de Gd sont répartis en 2 classes : macrocycliques et linéaires, différant par leur stabilité thermodynamique et donc leur tendance à se dissocier. Il est classiquement admis que les chélates de Gd ne traversent pas la barrière hémato-encéphalique saine. L’observation de ces hypersignaux au niveau du noyau dentelé du cervelet, du globus pallidus et parfois d’autres structures, remet en cause ce postulat.Les travaux de cette thèse visent à étudier le mécanisme d’accumulation du Gd dans le système nerveux central (voies de passage, localisations, spéciation du Gd accumulé). Les potentiels effets neurotoxiques associés à la présence de Gd dans le cerveau ont aussi été recherchés.Nous avons mis en évidence chez le Rat que l’accumulation cérébrale est d’autant plus importante que la stabilité thermodynamique du chélate de Gd est faible, confirmant les observations cliniques. Les hypersignaux T1 sont en effet liés à des injections répétées de chélates linéaires de Gd. Nous avons aussi établi qu’une insuffisance rénale modérée potentialise la capture cérébrale de Gd dans le cas d’un chélate de Gd linéaire. Nous avons observé que les structures cérébrales accumulent d’autant plus de Gd qu’elles sont riches en fer endogène. Une augmentation de la zincurie, après administration de chélates de Gd linéaires, a également été observée, suggérant un phénomène de transmétallation.La combinaison des techniques de fluorescence X (XRF), de microscopie électronique en transmission (TEM) et du NanoSIMS, a permis l’observation des dépôts de Gd à différentes échelles et sous différentes formes. Cela a permis de documenter les voies de passage du Gd, le rôle des métaux endogènes et du phosphore. L’analyse XRF a permis d’observer qu’au sein des noyaux cérébelleux profonds du Rat, la majorité du Gd est accumulée sous la forme de structures allongées et ramifiées. Ces structures pourraient être des vaisseaux sanguins. Le Gd serait accumulé dans l’espace périvasculaire. En TEM, des dépôts insolubles de Gd ont été observés dans les lames basales de vaisseaux, dans l’interstitium cérébelleux, et dans l’espace périvasculaire. Ces dépôts à l’apparence épineuse sont riches en phosphore, suggérant des dépôts de GdPO₄. Du Gd et du phosphore ont également été identifiés dans des cellules gliales, au sein de pigments intracellulaires de lipofuscine. Aucun dépôt de Gd n’a été trouvé chez des rats traités par un chélate de Gd macrocyclique.L’hypothèse mécanistique établie consiste en l’accès précoce des chélates de Gd au liquide céphalo-rachidien (LCR), puis leur diffusion passive dans le parenchyme proche des ventricules cérébraux, à travers l’épendyme. Arrivés dans des zones riches en métaux endogènes et/ou en phosphore, leschélates de Gd les moins stables thermodynamiquement se dissocieraient, le Gd se liant à des macromolécules endogènes, ou précipitant. La circulation du LCR le long des artérioles pénétrantes piègerait également du Gd au niveau périvasculaire. Les chélates de Gd intacts seraient éliminés par le système glymphatique périvasculaire ou « drainage périartériel intrapariétal ». On retrouve aussi du Gd probablement dissocié à ce niveau.Hormis une hypoactivité, non spécifique, les études neurocomportementales, histopathologiques et neurochimiques menées chez le Rat n’ont pas permis de mettre en évidence une toxicité avérée, même à des doses élevées. (Soutenue le 11 février 2019)

2017

Outils moléculaires pour l’étude des G-quadruplex au sein du génome
Joël Lefebvre

Résumé

L’acide désoxyribonucléique se structure chez les êtres vivants de différentes façons. La plus connue est sa forme double hélice mais de nombreuses autres structures secondaires existent et notamment les G-quadruplex. Il s’agit d’une structure basée sur le repliement d’un brin d’ADN possédant des répétitions de guanines. L’association de quatre guanines entre elles par liaisons hydrogène forme un plan appelé G-quartet. Ce réseau de liaisons hydrogène est appelé appariement de Hoogsteen. L’empilement d’au moins deux quartets autour d’un cation monovalent comme le potassium ou le sodium constitue la structure G-quadruplex. Ces structures ont été très étudiées lors des vingt dernières années et il a été montré qu’elles sont impliquées dans de nombreux mécanismes biologiques tels que la réplication, la transcription, la traduction et également le maintien des télomères. La présence des G-quadruplex peut provoquer une instabilité importante aussi bien génétique qu’épigénétique. C’est pourquoi de nombreuses méthodes ont été développées afin de localiser et comprendre le rôle de ces structures in vivo. Pour cela, un large panel d’outils moléculaires a été utilisé cependant il est encore difficile, à partir de ce panel, d’apporter une réponse à toutes les questions sur l’implication des G-quadruplex au niveau du génome. Lors de ce travail de thèse, nous avons alors développés de nouvelles molécules capables de cibler sélectivement les G-quadruplex au sein d’un milieu biologique complexe à partir de deux ligands PDC et PhenDC3 affins et sélectifs pour les structures G-quadruplex.Sur la base de molécules de référence que sont PhenDC3 et PDC, de nombreux ligands ont été mis au point. D’une part, des ligands fonctionnalisés avec une biotine et/ou un groupement photoactivable ont été synthétisés afin de capturer et d’extraire des structures G-quadruplex dans un milieu biologique. D’autre part, des dérivés capables d’être fonctionnalisés in cellulo par l’utilisation de chimie bioorthogonale ont également été obtenus. Ceci permet d’ajouter une fonction (fluorescente ou biotine…) après que le dérivé ait interagi avec sa cible cellulaire. L’ensemble des composés a été évalué par des techniques biophysiques, l’expérience de FRET-melting et l’expérience de FID, afin de mesurer leur affinité pour différentes structures G-quadruplex et leur sélectivité. Nous avons proposé une relation entre les deux expériences afin d’avoir un classement de ligands le plus approprié pour les G-quadruplex.Un des objectifs majeurs de ce travail était de localiser les ligands de G-quadruplex au sein de cellules cancéreuses humaines. Dans un premier temps, toute une étude au sein de cellules fixées a été réalisée en utilisant deux réactions de chimie « click », la réaction de cycloaddition d’un azoture et d’un alcyne catalysée par le cuivre (CuAAC) et la réaction de cycloaddition d’une cyclooctyne et d’un azoture (SPAAC). L’étude s’est, dans un second temps, poursuivie au sein de cellules vivantes en utilisant uniquement la réaction SPAAC à cause de la toxicité in cellulo du cuivre.Ces composés ont également été testés pour l’extraction de G-quadruplex à l’aide de billes magnétiques recouvertes d’une fonction cyclooctyne. Cependant, les résultats observés, lors de cette étude préliminaire, n’ont pas été concluants et demandent une mise au point pour optimiser le système. (Soutenue le 15 décembre 2017)


Suivi thérapeutique d’un traitement par photothérapie dynamique sur des modèles murins de rétinoblastome

Stéphanie Lemaitre

Résumé

Le rétinoblastome est la tumeur intraoculaire primitive la plus fréquente de l’enfant. Les traitements actuels du rétinoblastome sont associés à de nombreux effets secondaires. De nouvelles approches thérapeutiques (telles que la photothérapie dynamique [PDT] ou les injections intra-vitréennes [IVT] de chimiothérapies) doivent donc être évaluées sur des modèles animaux, en vue d’une éventuelle application clinique.Dans cette thèse nous avons tout d’abord caractérisé un modèle murin obtenu par xénogreffe orthotopique de cellules issues de rétinoblastomes humains. Nous avons montré que la croissance tumorale intraoculaire est possible dans des lignées de souris immunodéficientes (Swiss-nude et SCID [severe combined immunodeficiency]) et dans une lignée immunocompétente (B6Albino). En raison du taux de prise tumorale insuffisant (entre 28.4% et 68.8% selon les lignées de souris utilisées) et des complications oculaires liées à l’injection orthotopique de cellules tumorales (cataracte, décollement de rétine chronique), les tests thérapeutiques (PDT et IVT de chimiothérapies) ont ensuite été réalisés sur un modèle murin transgénique de rétinoblastome (LHBetaTag).En vue du traitement par PDT, une étude de biodistribution par IRM (imagerie par résonance magnétique) du photosensibilisateur (PS, DEG-mannose) couplé au manganèse et une étude par dosage du PS ont été réalisées. Elles ont toutes les deux montré que l’illumination de la tumeur doit être réalisée 24 à 48h après l’administration intra-péritonéale du PS (ce qui correspond au « drug-to-light interval » du traitement par PDT). En utilisant ces paramètres, le traitement par PDT a été efficace sur les tumeurs rétiniennes des souris LHBetaTag. Au niveau de la zone traitée par PDT, il y a ainsi eu 91.7% de cicatrices choriorétiniennes en OCT (optical coherence tomography) pour un « drug-to-light interval » de 24h et 100% de cicatrices choriorétiniennes pour un « drug-to-light interval » de 48h. La rétine non tumorale située en dehors de la zone traitée par PDT avait un aspect normal en histologie, ce qui est en faveur d’une absence de toxicité rétinienne de la PDT sur les tissus sains. Le traitement par laser seul n’a pas eu d’effet anti-tumoral.Des traitements par IVT de chimiothérapies ont aussi été évalués sur les tumeurs rétiniennes des souris LHBetaTag. Les molécules utilisées ont été le melphalan, le carboplatine et le topotecan, administrées en mono ou en bithérapie. Nous avons montré que 4 IVT hebdomadaires de carboplatine à la dose de 1.5 µg ont la meilleure efficacité anti-tumorale (83.3% d’yeux sans masse tumorale en histologie) pour une toxicité rétinienne faible (21.4% d’yeux où il y a eu une diminution de l’épaisseur de la rétine non tumorale en OCT au cours du suivi in vivo). Le carboplatine semble donc être une alternative intéressante au melphalan, qui est actuellement la molécule la plus utilisée en clinique pour les IVT dans le rétinoblastome mais qui est associé à une toxicité rétinienne importante.En conclusion, ces études précliniques réalisées sur un modèle murin de rétinoblastome (LHBetaTag) montrent que la PDT est envisageable pour le traitement des tumeurs rétiniennes dans le rétinoblastome humain. Les IVT de carboplatine sont une perspective pour le traitement des flocons intra-vitréens dans cette maladie. Des évaluations fonctionnelles (électrorétinogramme, étude du réflexe optocinétique) devront cependant être réalisées chez la souris avant un éventuel passage en clinique afin de mieux caractériser une éventuelle toxicité rétinienne de ces traitements. (Soutenue le 27 novembre 2017)


Développements méthodologiques et logiciels pour l’imagerie X multimodale par balayage sur la ligne de lumière Nanoscopium

Antoine Bergamaschi

Résumé

L’objet de cette thèse est le développement méthodologique et logiciel d’outils permettant de traiter les grands volumes de données multimodales et tomographiques produits sur Nanoscopium. La technique de microscopie en rayons X durs par balayage permet l’acquisition simultanée d’information par contraste d’absorption, de phase, de diffusion et de fluorescence X. L’association des techniques de balayage avec l’infrastructure d’acquisition rapide FLYSCAN permet de proposer aux futurs utilisateurs de la ligne Nanoscopium de faire des acquisitions tomographiques multimodales. Un des principaux enjeux de cette approche est le traitement en ligne des grands volumes de données générées durant l’acquisition. Le résultat principal de cette thèse est le logiciel MMXI, dédié au traitement et à la reconstruction des jeux de données multimodales 2D et 3D. Ce logiciel intègre un algorithme dédié à la lecture de gros volumes de données, différentes fonctions de réduction de données, deux algorithmes de reconstruction de phase (intégration dans l’espace de Fourrier et technique itérative) et des algorithmes de reconstruction tomographiques (rétroprojection filtré ou itérative). L’ensemble des méthodes implémentées, des applications permettant de valider ces développements ainsi que les perspectives d’évolution sont présentées dans ce manuscrit. (Soutenue le 7 mars 2017)

2016

Autour du noyau imidazo[4,5-b]pyridine : inhibiteurs potentiels de la protéine kinase Tyro3 et fonctionnalisation directe de liaisons C – H
Tom Baladi

Résumé

Étant au quatrième rang des cancers les plus fréquents chez l’homme, le cancer de la vessie représente un enjeu médical important. Pourtant, à ce jour, seuls des traitements chirurgicaux handicapants et/ou chimiothérapiques non spécifiques peuvent être envisagés. Le projet de thèse s’inscrit dans le cadre de la recherche de thérapies ciblées du cancer de la vessie en ayant pour objectif le blocage, au niveau moléculaire et de manière sélective, des voies de signalisation mises en œuvre par la tyrosine kinase Tyro3 au sein des cellules cancéreuses. La mise en évidence de la surexpression de ce récepteur membranaire dans la majorité des tumeurs de vessie et son rôle dans la survie des cellules cancéreuses ont en effet permis de valider Tyro3 comme cible thérapeutique pour ce type de cancers. Le projet peut se diviser en trois parties : le développement de nouvelles méthodologies de synthèse autour du motif imidazo[4,5-b]pyridine, la synthèse d’une librairie de candidats inhibiteurs en utilisant les méthodes mises au point et enfin l’étude des relations structure-activité vis-à-vis de la protéine kinase Tyro3. (Soutenue le 18 novembre 2016)

Photothérapie dynamique vectorisée contre le rétinoblastome : conception, synthèse et études photobiologiques de photosensibilisateurs excitables à deux photons
Su Chen

Résumé

La photothérapie dynamique (PDT) est un nouveau traitement n’induisant potentiellement pas de mutation et utilisable pour lutter contre le rétinoblastome. Les dérivés de porphyrine utilisés comme Ps dans la Thérapie PhotoDynamique (PDT) sont largement étudiés depuis la naissance du premier Ps de synthèse (l’HpD). Une limitation importante de la PDT provient de la faible profondeur (confinée près de la surface) de pénétration de la lumière (λ <700 nm) employée pour l’excitation du Ps. Afin de fournir une énergie d’activation suffisante pour produire l’oxygène singulet dans la fenêtre thérapeutique entre 700-1300, le processus d’absorption à deux photons a été proposé. Les Ps excitables par l’absorption simultanée de deux photons conduisent au concept de PDT à deux photons (PDT-ADP). Ce processus ayant une faible probabilité, son application demande le développement de nouveaux Ps avec une section efficace importante. Une autre limitation de la PDT est la faible sélectivité et spécificité des Ps actuels pour les cellules tumorales. Un ciblage actif de récepteurs membranaires spécifiques des cellules tumorales représente une solution possible. Il a été rapporté que des récepteurs de type lectine reconnaissant certains sucres sont surexprimés par des cellules malignes. Nous présenterons la synthèse et les résultats photocytotoxiques de dimères dissymétriques de porphyrine P-Y-P’, inspirée d’études précédentes du laboratoire, privilégiant l’introduction de trois chaînes para-phénoxy-diéthylène glycol mannose sur trois des positions méso de porphyrines optimisés pour l’absorption à deux photons et vectorisés vers des lectines membranaires.Pour contourner le problème de solubilité des porphyrines dimères en milieu aqueux et améliorer l’internalisation de Ps dans les cellules tumorales, nous avons analysé le comportement interfacial des porphyrines dimères à l’interface air-tampon, étudié leur incorporation dans les liposomes à l’aide de la technique de la fluorescence, et évalué l’interaction entre porphyrin dimères et la Concanavaline A (une lectine extraite de Canavalia ensiformis qui reconnaît de manière spécifique l’alpha-D-mannose). (Soutenue le 15 février 2016)

2015

Conception d’outils chimiques pour la détection des structures d’ADN G-quadruplex
Élodie Morel

Résumé

Des structures secondaires d’acides nucléiques atypiques, les structures G-quadruplex, peuvent se former autour d’un cation (K+ ou Na+) dans les régions riches en guanines, grâce à une association de type Hoogsteen. La formation de ces structures est impliquée dans de nombreux mécanismes biologiques, comme la réplication, la transcription ou l’épissage. Elles peuvent affecter l’architecture de l’ADN jusqu’au niveau de la chromatine et provoquer une instabilité importante, tant génétique qu’épigénétique. De nombreuses méthodes ont été développées afin de détecter ces structures in vivo et de comprendre leurs implications au niveau cellulaire. Cependant, le panel d’outils moléculaires disponible actuellement ne permet pas une exploration du génome complète et sélective. Nous avons souhaité développer des outils, capables de sonder efficacement un milieu biologique complexe à la recherche de structures G-quadruplex et d’évaluer le potentiel d’une stratégie thérapeutique anti-tumorale ciblant ces structures. Nous avons mis au point un panel de composés combinant des ligands d’ADN G-quadruplex (PDC, PhenDC3 et Métal-ttpy) avec une biotine et un groupement photoactivable, permettant la capture et l’extraction de structures G-quadruplex de milieux biologiques complexes. Les ligands ont été évalués grâce aux techniques de FID et de FRET-melting, et sélectionnés pour leur affinité mais aussi pour leur affinité pour l’ADN G-quadruplex, assurant un ciblage efficace. Il a également été possible de piéger directement une séquence G-quadruplex en utilisant un complexe de platine, formant un adduit métallique avec les bases de l’ADN. Grâce ce type de ligand d’ADN G-quadruplex, la liaison de coordination métallique joue le rôle de marqueur covalent. Nous avons déterminé sur gel d’électrophorèse la localisation des adduits formés par des complexes dérivés du tolylterpyridine-platine (Pt-ttpy) et étudié la cinétique de platination de l’ADN G-quadruplex. La fonctionnalisation du complexe Pt-ttpy par des groupements photoactivables a permis de réaliser un double-ancrage covalent dans une structure d’ADN G-quadruplex. Par ailleurs, la fonctionnalisation avec un fluorophore a conduit aux premières évaluations en milieu cellulaire.Enfin, notre panel de composés a été testé dans des conditions de capture supportée d’ADN G-quadruplex. Une mise au point de la technique de capture a été réalisée en utilisant des billes magnétiques recouvertes de streptavidine. Les expériences de capture sur billes ont montré que l’efficacité de nos outils varie en fonction de la topologie de la structure G-quadruplex ciblée et du ligand utilisé. Par ailleurs, le groupement photoactivable introduit sur certains de ces outils n’a pas permis d’améliorer la capture d’ADN G-quadruplex. Cependant, il a été possible d’utiliser ces outils en présence d’ADN génomique pour capturer efficacement de fragments d’ADN télomérique, par effet G-quadruplex. (Soutenue le 18 décembre 2015)

Les télomères, cibles potentielles des dérivés du cis-platine, fixation et conséquences sur leur structure
Samar Ali

Résumé

Les télomères sont des structures spécifiques nucléoprotéiques localisées aux extrémités des chromosomes. Ils protègent les chromosomes contre la dégradation, les recombinaisons et les fusions et permettent qu’ils ne soient pas reconnus comme des cassures à l’ADN. Ils sont composés d’ADN télomérique, constitué de répétitions de la séquence TTAGGG, qui se prolonge par une extrémité 3’ simple brin, et de six protéines télomériques dont la protéine TRF2 qui sont indispensables au maintien de l’intégrité des télomères. Le brin riche en guanines est capable, en présence de cations monovalents, de se replier sur lui- même en une structure à quatre brins, la structure G-quadruplexe. Sa stabilisation par des ligands est une stratégie anti-tumorale car elle provoque des perturbations télomériques conduisant à la mort des cellules cancéreuses. Comme les télomères sont des séquences riches en guanines, ils peuvent aussi constituer une cible potentielle des complexes de platine. Notre objectif consiste à augmenter le ciblage des télomères en associant au sein de la même molécule, un ligand de structure G-quadruplexes qui reconnaitrait ces structures avec un atome de platine qui les bloquerait ensuite irréversiblement. La tolyl-terpyridine-Pt(II), (Pt-ttpy) a été conçue dans ce but. Elle stabilise et se fixe irréversiblement sur les structures G-quadruplexe in vitro. Nous avons analysé les perturbations télomériques induites par ce ligand de G-quadruplexes (Pt-ttpy) en comparaison avec des complexes qui ne stabilisent pas ces structures (terpyridine-Pt(II) ou Pt-tpy, et le cis-platine drogue anti-tumorale utilisée en chimiothérapie) et quantifié le nombre de complexes fixés au niveau des télomères. Nous avons travaillé sur deux lignées cancéreuses d’ovaire sensibles et résistantes au cis-platine (A2780 A2780-cis) et une lignée non-cancéreuse BJ-hTERT. Les complexes Pt-ttpy et Pt-tpy inhibent la prolifération cellulaire des cellules cancéreuses à des doses de l’ordre du µM et ne montrent aucune résistance croisée avec le cis-platine. Nos résultats obtenus par ChIP et immunofluorescence montrent sans ambiguïté que Pt-ttpy délocalise 50% de protéine TRF2 des télomères uniquement des cellules cancéreuses et augmente les dommages au niveau de l’ADN télomérique par rapport aux complexes qui ne sont pas des ligands de G-quadruplexes, sans pour autant induire un raccourcissement des télomères. Donc l’association d’un ligand de G-quadruplexes avec un atome de platine au sein d’une même molécule permet de cibler préférentiellement les télomères des cellules cancéreuses par rapport au complexe de platine seul. Cependant, les perturbations télomériques induites par Pt-ttpy n’ont pas été augmentées par rapport aux meilleurs ligands de G-quadruplexes connus. De façon intéressante, et pour la première fois dans la littérature, nous avons montré que nos deux complexes Pt-ttpy, Pt-tpy ciblent directement les télomères des cellules cancéreuses puisqu’ils s’y fixent. Ils augmentent la préférence de fixation à l’ADN télomérique/l’ADN génomique d’un facteur 15 par rapport au cis-platine. Cette préférence de fixation semble indépendante de la reconnaissance de structures G-quadruplexes mais semble plutôt dépendre de la nature des complexes de platine. D’autre part, à cause de la faible quantité de complexes retrouvée au niveau des télomères, leur fixation aux télomères ne peut être responsable, à elle seule, la délocalisation de TRF2, suggérant que le déplacement de TRF2 des télomères n’est pas dû un empêchement physique mais plutôt à une réponse biologique. Ainsi, nos travaux montrent que les molécules hybrides ligands de structure G-quadruplexes-Pt(II) sont une stratégie intéressante pour ciblage des télomères des cellules cancéreuses. Ceci ouvre la voie au développement de nouveaux complexes dont le facteur de préférence pour l’ADN télomérique et également la quantité de complexe fixée au niveau de l’ADN télomérique seraient augmentés par rapport à Pt-ttpy. (Soutenue le 24 novembre 2015)

Développement des sondes fluorescentes pour la détection de l’ADN quadruplex
Xiao Xie

Résumé

Les acides nucléiques simple-Brins contenant des répétitions de guanines peuvent former des structures secondaires non canoniques dites G-Quadruplexes, composées de plusieurs couches de quartets de guanine. Malgré de nombreuses études in vivo, les preuves de présence de structures quadruplexes in vivo restent indirectes. L’objectif de ce travail était la recherche de sondes fluorescentes capables de signaler la présence d’ADN quadruplex et détecter sa structure (topologie).Deux séries de sondes fluorescentes ont été envisagées et préparées : les colorants styryles (majoritairement distyryles) et les dérivés PDC-Coumarines. La conception de ces deux séries est basée sur l’échafaudage bisquinolinium pyrido¬dicarboxamide (PDC-360A), un ligand sélectif ayant une bonne affinité vis-À-Vis des structures d’ADN quadruplexes, mais qui est non-Fluorescent. En s’inspirant de cette molécule et du motif styryle, connu pour ses propriétés spectroscopiques, nous avons préparé une librairie de colorants distyryles. Une deuxième série, les dérivés PDC-Coumarine, est synthétisée afin d’introduire la propriété fluorescente de la coumarine dans le PDC par une liaison covalente.Les propriétés de colorant de ces deux librairies (65 composés) ont été étudiées en présence de nombreuses structures d’ADN (quadruplex et duplex) en utilisant un criblage par fluorescence sur microplaques et des méthodes de titration. Nos résultats montrent que certains colorants synthétisés possèdent une haute réponse fluorimétrique (facteur d’augmentation de fluorescence de 200 à 600) vis-À-Vis de différentes structures d’ADN et d’ARN quadruplex, ayant une très faible réponse fluorimétrique vis-À-Vis de l’ADN duplex. Cela permet de marquer sélectivement l’ADN quadruplex dans la solution ou sur les gels d’électrophorèse. Ces résultats représentent une première étape vers l’utilisation de ces sondes dans un contexte biologique, par exemple dans l’imagerie de fluorescence. (Soutenue le 28 janvier 2015)

2012

Sondes fluorescentes vinyl-triphénylamines optimisées pour la microscopie biphotonique : Étude des intéractions non covalentes avec l’ADN et la HSA et application à l’imagerie cellulaire
Blaise Dumat

Résumé

L’avènement de la microscopie biphotonique et des techniques dites de « super-résolution » ont permis d’améliorer les performances de la microscopie de fluorescence et de l’appliquer à l’imagerie intravitale et à l’analyse des tissus biologiques. Ces techniques requièrent néanmoins l’emploi de sondes aux propriétés optiques et biologiques optimisées.Plusieurs séries de colorants cationiques basés sur le motif vinyl-triphénylamine (TP) ont été développés pour le marquage d’ADN. Ces fluorophores rouges ou jaunes dont l’émission de fluorescence est commutée par l’interaction avec l’ADN sont des ligands de petit sillon de l’hélice B et possèdent des sections efficaces d’absorption à deux photons élevées.Les TP marquent l’ADN du noyau des cellules fixées ou en apoptose avec une intensité et un contraste élevés. Elles sont non-cytotoxiques, photostables et sont perméables à la membrane cellulaire. L’optimisation des propriétés a permis d’obtenir la TP-2Bzim, qui possède une brillance biphotonique parmi les plus élevées rapportées dans la littérature pour des molécules de faible poids moléculaire (383 GM) et permet une détection en microscopie biphotonique à basse concentration et à faible puissance d’excitation. En cellules vivantes, les TP sont localisées dans les mitochondries mais, sous excitation mono- ou bi-photonique constante, elles déclenchent l’apoptose de la cellule et se relocalisent dans le noyau. Le phénomène peut être imagé par fluorescence, et les TP pourraient donc être employées comme photosensibilisateurs théranostiques.Enfin, une stratégie de synthèse pour fonctionnaliser la TP-2Bzim a été développée. Elle a ainsi pu être couplée à des oligonucléotides et à un PNA pour la détection d’hybridation par fluorescence et à l’acide folique et à la spermidine pour le ciblage de cellules cancéreuses. (Soutenue le 7 décembre 2012)

Synthèse et caractérisation de photosensibilisateurs à absorption biphotonique pour application à la photothérapie dynamique : Ciblage du rétinoblastome
Fabien Hammerer

Résumé

Depuis quelques années, l’Institut Curie s’est engagé, aux cotés de l’association Rétinostop,dans la lutte contre le rétinoblastome, une tumeur rétinienne chez l’enfant en bas âge. Nous pensons que l’utilisation de la Photothérapie Dynamique (PDT)permettrait d’éviter les effets secondaires néfastes auxquels les thérapies utilisées actuellement donnent lieu. Dans ce cadre, les travaux au laboratoire se sont portés sur la préparation de photo sensibilisateurs (PS) glycoconjugués permettant de cibler les cellules tumorales par interactions spécifiques avec les récepteurs lectiniques surexprimés par ces dernières.Afin d’éviter les dommages liés à l’exposition à la lumière des tissus sains à proximité de la tumeur, notre intérêt s’est récemment porté sur l’Absorption à Deux Photons (ADP), phénomène localisé et permettant l’excitation sélective duPS dans le volume de la tumeur. Cette technique permettrait d’épargner les tissus rétiniens fragiles.Ce rapport présente les travaux effectués au laboratoire sur le développement de PS absorbant à deux photons (PS-ADP) glycoconjugués pour le ciblage du rétinoblastome. Ceux-ci sont articulés autour de trois concepts moléculaires.Les oligomères de porphyrines ont été rapportés comme de bons candidats pour la PDT à Absorption Deux Photons (PDT-ADP). La préparation d’analogues glycoconjugués a été réalisée et leurs propriétés photophysiques et biologiques analysées. Ces composés présentent une haute section efficace ADP et de bons rendements quantiques de production d’oxygène singulet. Une étude complémentaire est en cours de façon à améliorer leurs propriétés d’internalisation cellulaire.Ces composés possèdent également des propriétés de fluorescence sensibles à la température et pourraient constituer un point de départ intéressant pour le développement de sondes fluorescentes ratiométriques de températures.Les hybrides conjugués de porphyrine et triphénylamines (PTP) présentent également des propriétés prometteuses en vue de leur application à la PDT-ADP.Nous proposons une étude de l’influence de plusieurs groupements sur ces propriétésparmi lesquels les substituants de la triphénylamine, les substituants des phénylesméso de la porphyrine (triéthylène glycol ou diéthylène glycol mannosyles)et un atome de zinc internalisé dans le macrocycle tétrapyrrolique. Les hybrides préparés présentent un excellent rendement quantique de production d’oxygènesingulet dans les solvants polaires et une bonne section efficace ADP. Des difficulté sont été rencontrés quant à leur internalisation cellulaire.Une seconde famille d’hybrides méthylés a été préparée s’appuyant sur les propriétés d’exaltation des triphénylamines cationiques par interaction avec l’ADN.Ces composés présentent de faibles propriétés de fluorescence et de photosensibilisation dans l’eau. Dans le glycérol l’émission de fluorescence est restaurée grâce à un transfert d’énergie entre les deux entités. Ces composés possèdent une bonne phototoxicité in vitro et permettent l’imagerie de fluorescence de cellules. (Soutenue le 4 décembre 2012)