Séquençage ADN haut débit (NGS)

Le séquençage de nouvelle génération a désormais atteint un débit et une précision tels qu’il permet aux chercheurs de mettre en œuvre des projets de génomique de très grande envergure en un temps raisonnable et des coûts abordables.

La plateforme NGS de l’Institut Curie a connu un essor majeur depuis 2012 grâce à l’obtention d’un financement EQUIPEX «  Investissement d’avenir » piloté par l’ANR (ANR-10-EQPX-03). Cette subvention a non seulement permis d’acheter des séquenceurs de très haut-débit mais aussi d’équiper un laboratoire entier au 7ème étage de l’hôpital et de renforcer l’effectif en charge de mener à bien les projets de séquençage.

Objectifs

  • Proposer aux équipes de recherche de l’Institut Curie un service d’excellence dans le séquençage haut-débit
  • Offrir un accompagnement scientifique et technique lors des étapes de design expérimental en proposant les stratégies de séquençage les plus adaptés
  • Maintenir une grande flexibilité afin de répondre au mieux aux problématiques des équipes de recherche (développement et implémentation de nouvelles stratégies)

Activité

Sous la supervision d’Olivier Delattre et d’Alain Nicolas, la plateforme NGS (Next Generation Sequencing) propose un service d’excellence dans le séquençage haut-débit. Ceci inclut l’organisation de réunions de projet où la stratégie de séquençage la plus appropriée pour répondre à la question biologique posée sera déterminée. Un grand nombre de protocoles de séquençage a déjà été développé et est utilisé en routine au sein de la plateforme pour permettre la mise en œuvre des applications les plus communes en génétique et épigénétique (séquencage de génomes entiers, d’exomes ou de panels de gènes, séquençage d’ARN, ChIP-seq …). De plus, la plateforme est ouverte au développement et à l’implémentation de nouveaux protocoles afin de répondre aux besoins plus spécifiques de certaines équipes de recherche.

Une fois les aspects techniques définis, les échantillons sont apportés à la plateforme et la préparation des banques compatibles avec les différents séquenceurs est réalisée par l’équipe NGS. Après passage sur les séquenceurs, les données brutes sont transférées à la plateforme Bioinformatique de l’U900 pour permettre le contrôle qualité et une analyse primaire sur les données issues du séquençage. Enfin, ces dernières sont envoyées aux équipes de recherche avec des rapports complets de qualité et d’analyse.

La plateforme n’est pas uniquement dévouée à la recherche fondamentale et est impliquée dans de nombreux projets de recherche translationnelle en collaboration avec l’U830, le département de transfert et l’Hôpital Curie.

Réseaux

  • Membre actif de l’infrastructure nationale France Génomique, un consortium français dédié à la mutualisation et à l’ouverture des ressources NGS au profit des laboratoires de recherche.
  • Membre du réseau européen Core For Life, qui regroupe les plateformes technologies de grands instituts européens visant notamment à faciliter le partage d’expertise et la veille technologique.

Formation

  • Organisation du module Génomique pour le Master 2 « Ingénieur de plateforme » de l’Université de Paris.
  • Participation au cours sur le NGS de la Licence Pro Génomique de l’ENCPB (Paris).
  • Participation aux « International Courses » organisés par l’Institut Curie
  • Participation aux cours technologiques sur le NGS pour l’école d’ingénieurs EPF (Sceaux).
  • Participation aux formations bio-informatiques organisées par l’U900.
  • Participation au cours sur le NGS pour le Master 2 de l’école doctorale de Cancérologie de Paris (Saclay).

Services

  • Mise à disposition d’une interface de soumission et de suivi de projets de NGS
  • Préparation des banques nécessaires à la mise en œuvre de nombreuses applications :
    • Séquençage de génomes complets, d’exomes et de panels de gènes
    • Analyse du transcriptome (RNAseq ciblant les ARN non-codants et/ou les ARNm)
    • Caractérisation de l’épigénome : ChIP-seq pour étudier les modifications des histones et l’identification des sites de fixation de protéines à l’ADN. Analyse des régions ouvertes de la chromatine de cellules uniques (ATAC-seq single-cell)
    • Séquençage des ARNm de cellules uniques (technologie 3’ seq et Spatial Transcriptomics de 10X Genomics)
  • Mise à disposition de pipelines d’analyses pour les applications de routine
  • Support bioinformatique à travers une étroite collaboration avec la plateforme bioinformatique (U900).

Equipements

  • 1 séquenceur Illumina très haut-débit : 1 NovaSeq 6000 dédié aux applications nécessitant une grande quantité de données (génomes humains et séquençage d’exomes, analyse du transcriptome …).
  • 2 séquenceurs Illumina de paillasse : 2 MiSeq utilisés pour des projets nécessitant une faible profondeur de séquençage et pour des validations de constructions de banques particulières.
  • 1 séquenceur Long Read PacBio : 1 Sequel II permettant le séquençage de longs fragments (>10kb) et de séquences répétées.
  • 1 Chromium 10X Genomics permettant notamment l’analyse du transcriptome de cellules uniques.
  • 1 LabChip GXII Touch, 1 BioAnalyzer, 1 Femto Pulse, 1 CFX96 real-time PCR system et 1 Pippin Pulse utilisés pour réaliser les contrôles qualité des échantillons et des banques.

Tous les séquençeurs ont été financés par la subvention ICGex. Sauf le Novaseq qui a été financé par l’ITMO Cancer et l’Hôpital Curie. Le Chromium de 10X Genomics a quant à lui été financé par le SiRIC.

PacBio Sequel II Long read sequencer PacBio Sequel II Long read sequencer
Illumina NovaSeq 6000 high-throughput sequencer Illumina NovaSeq 6000 high-throughput sequencer

Pour nous joindre :

Objectifs en 2021

  • Implémentation de la technologie Visium Spatial Gene Expression de 10X Genomics.
  • Implémentation de l’application HiFi reads avec le Sequel II de Pacific Biosciences (reads de qualité >Q20 et de plusieurs kb de longueur).
  • Mise en place d’une démarche Qualité en vue d’obtenir la certification ISO 9001

Publications clés

Année de publication : 2020

Sophie Loeillet, Mareike Herzog, Fabio Puddu, Patricia Legoix, Sylvain Baulande, Stephen P. Jackson, Alain G. Nicolas (2020 Oct 6)

Trajectory and Uniqueness of Mutational Signatures in Yeast Mutators

Proceedings of the National Academy of Sciences : 117 n° 40 : 24947-24956 : DOI : 10.1073/pnas.2011332117
Yann Kieffer, Hocine R. Hocine, Géraldine Gentric, Floriane Pelon, Charles Bernard, Brigitte Bourachot, Sonia Lameiras, Luca Albergante, Claire Bonneau, Alice Guyard, Karin Tarte, Andrei Zinovyev, Sylvain Baulande, Gerard Zalcman, Anne Vincent-Salomon, and Fatima Mechta-Grigoriou (2020 May 20)

Single-Cell Analysis Reveals Fibroblast Clusters Linked to Immunotherapy Resistance in Cancer

Cancer Discovery : DOI : 10.1158/2159-8290.CD-19-1384
Marie-Ming Aynaud, Olivier Mirabeau, Nadege Gruel, Sandrine Grossetête, Valentina Boeva, Simon Durand, Didier Surdez, Olivier Saulnier, Sakina Zaïdi, Svetlana Gribkova, Aziz Fouché, Ulykbek Kairov, Virginie Raynal, Franck Tirode, Thomas G P Grünewald, Mylene Bohec, Sylvain Baulande, Isabelle Janoueix-Lerosey, Jean-Philippe Vert, Emmanuel Barillot, Olivier Delattre, Andrei Zinovyev (2020 Feb 13)

Transcriptional Programs Define Intratumoral Heterogeneity of Ewing Sarcoma at Single-Cell Resolution.

Cell reports : 30 : 1767-1779.e6 : DOI : 10.1016/j.celrep.2020.01.049
Floriane Pelon, Brigitte Bourachot, Yann Kieffer, Ilaria Magagna, Fanny Mermet-Meillon, Ana Costa, Anne-Marie Givel, Youmna Attieh, Jorge Barbazan, Laetitia Fuhrmann, Stéphanie Descroix, Danijela Vignjevic, Pascal Silberzan, Isabelle Bonnet, Claire Bonneau, Maria Carla Parrini, Anne Vincent-Salomon & Fatima Mechta-Grigoriou (2020 Jan 21)

Cancer-associated fibroblast heterogeneity in axillary lymph nodes drives metastases in breast cancer through complementary mechanisms

Nature Communication : 11 : 1-20 : DOI : 10.1038/s41467-019-14134-w
Rafael Galupa, Elphège Pierre Nora, Rebecca Worsley-Hunt, Christel Picard, Chris Gard, Joke Gerardavan Bemmel, Nicolas Servant, Yinxiu Zhan, Fatima El Marjou, Colin Johanneau, Patricia Diabangouaya, Agnès Le Saux, Sonia Lameiras, Juliana Pipoli da Fonseca, Friedemann Loos, Joost Gribnau, Sylvain Baulande, Uwe Ohler, Luca Giorgetti, Edith Heard (2020 Jan 16)

A Conserved Noncoding Locus Regulates Random Monoallelic Xist Expression across a Topological Boundary

Molecular Cell : 77 n°2 : 352-367.e8 : DOI : 10.1016/j.molcel.2019.10.030

Année de publication : 2019

Roberta Ragazzini, Raquel Pérez-Palacios, Irem H Baymaz, Seynabou Diop, Katia Ancelin, Dina Zielinski, Audrey Michaud, Maëlle Givelet, Mate Borsos, Setareh Aflaki, Patricia Legoix, Pascal W T C Jansen, Nicolas Servant, Maria-Elena Torres-Padilla, Deborah Bourc'his, Pierre Fouchet, Michiel Vermeulen, Raphaël Margueron (2019 Aug 26)

EZHIP constrains Polycomb Repressive Complex 2 activity in germ cells.

Nature communications : 10 : 1-18 : DOI : 10.1038/s41467-019-11800-x
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